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實時熒光定量PCR系統(tǒng)
技術(shù)的基本原理
在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR進程，在PCR循環(huán)中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標。并且引入一個Ct值概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號由本底開始進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)。
熒光閾值相當于基線熒光信號的平均信號標準偏差的10倍。一般認為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的Ct值。通常用不同濃度的標準樣品的Ct值來產(chǎn)生標準曲線，然后計算相對方程式。
方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關(guān)系數(shù)，這樣才能認為實驗的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標準曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。
實時熒光定量PCR系統(tǒng)的軟件特點：
●反應板設(shè)置指南軟件使實驗設(shè)計非常簡單，包括復雜的多色熒光實驗；
●可選擇快速、標準或者9600反應模式；
●實時監(jiān)測擴增曲線；
●實驗過程中可以增加PCR循環(huán)數(shù)；
●自動設(shè)置熒光基線，自動計算熒光閾值使數(shù)據(jù)分析大大簡化；
●可在同一反應板采用多種標準曲線對靶基因進行定量，可以簡化工作流程以及下游產(chǎn)物分析；
●基因表達相對定量軟件提供強大的結(jié)果分析顯示，可以自動將多達10塊96孔板基因表達實驗數(shù)據(jù)同時分析，并自動去除無關(guān)項數(shù)據(jù)；
●自動SNP分析軟件可以簡單直觀的圖表輸出分型結(jié)果并自動進行分型質(zhì)量評分；
●解離曲線數(shù)據(jù)采集操作簡單，觀察方便，可以在儀器運行時觀察解離曲線數(shù)據(jù)；
●觀察實時擴增曲線時可以非常方便的標定所對應的樣品孔位置；
●光源使用時間監(jiān)測及儀器系統(tǒng)自我診斷程序。
